使用Neofect™ DNA transfection reagent
包装威尼斯人登录网址

Neofect™ DNA transfection reagent 为本公司研发合成的以非脂质阳离子聚合物为主的转染试剂,是新一代非病毒转染试剂。可以与DNA形成稳定的复合物,透过细胞膜进入细胞内,并保护DNA免受核酸酶的降解。该试剂对细胞毒性很小,可在含血清与抗生素的完全培养基中充分发挥作用。由于其温和高效的转染效率,非常适合病毒包装实验。

一:转染293T细胞

(以6 cm培养皿为例,不同培养体积使用情况见Table.1)
1. 转染前24 h,用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞,以含10%血清的培养基调整细胞密度为1*106
细胞,重新接种于6
cm细胞培养皿,37℃ 5% CO2 培养箱内培养。24 h待细胞密度达70%~90%时即可用于转染。
细胞状态对于病毒包装至关重要,因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。
2. 在转染前2小时,移除细胞上原有的培养基,换为新鲜的完全培养基(含10%血清的DMEM培养基)。
注意:培养基请勿添加抗生素
3. 向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA总量4-10ug,并加入相应体积的Opti-MEM混合均匀,调整总体积为 4 ml,在室温下温育5 分钟(见Table.1)。
核心质粒 4µg
包装质粒 :psPax2 3µg (四代系统 pMDLg/pRRE 2µg + pRSV-Rev 1µg)
病毒外壳质粒: pMD2.G 1~2 µg
注意:无血清稀释液建议采用Opti-MEM,无血清DMEM或150 mM NaCl溶液。
4. 向DNA稀释液中直接加入相应比例(DNA总量:Nefect = 1:1)4-10ul Neofect™ DNA transfection reagent轻柔混匀,
室温静置15-30分钟。转染复合物制备完成。
5. 将转染复合物加入细胞培养基中,轻柔混匀。

二:转染后换液(推荐)

6. 细胞转染6-12小时以后,检查细胞状态。将培养基吸走,添加新鲜的DMEM完全培养基。
7. 将培养皿返还到培养箱中。确保培养皿水平放置。

Table.1 不同细胞培养容器转染用量

细胞培养容器 起始铺板细胞数 Opt-MEM 体积 DNA的总量 Neofect™的量 培养基总量
60 mm dish 1*106 200 µl 4-10 µg 4-10 µl 4 ml
100 mm dish 2.0~3.0*106 500 µl 10-20 µg 10-20 µl 10 ml
150 mm dish 7.0~8.0*106 1 ML 30-50 ug 30-50 ul 30 ml

三:观察转染效率

转染24-48小时候观察转染效果。融合的多核细胞开始出现,大多数细胞仍然是贴壁的。如果载体质粒上带有荧光标
记,并且其启动子能够在293T 细胞中表达,那么可以看到超过95%细胞都会带有荧光。

四:病毒上清的收集

分别收集转染后24h,48h(以转染后时间为开始时间)的病毒上清,用0.45 um的滤器过滤病毒上清或3000rpm离心5分
钟,收集后置于4度冰箱保存,可直接用于感染实验。(4度只能保存14天)。

五:病毒浓缩(可选)

1. 将上步处理好的细胞上清样品分装33ml 到每个离心管中。
2. 将离心管两两配平,使重量偏差在0.1g 范围内。配平后盖上金属盖。
3. 使配平的离心管对称放置于超速离心转子中。
4. 设置离心转速100000g,4℃ 离心2 小时。
5. 离心结束后,将离心管从转子中拿出,可以看到在离心管底有一小团沉淀,倒掉上清。
将离心管倒扣在预先铺好的纸巾上,放置10 分钟,使残余液体流掉。可以用移液枪将挂在壁上的液滴吸走。
6. 加入无血清培养基(Opti-MEM 或 PBS/1% BSA)重悬病毒颗粒,保存于-80度
注意:如需感染非常敏感的细胞,建议加入4ML 20% 蔗糖到离心管底部并加入 26 ml 病毒上清液进行离心操作。